转自：美迪西Medicilon

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请问SPR做kinetics 1:1 binding拟合kd 超限导致拟合有误差，affinity拟合不可信，这样的数据如何拟合和分析?

董海辉：可以从以下几方面优化：

一是优化实验条件，降低分析物浓度至几十RU，提高流速，延长解离时间，以提高信号捕捉的准确性；

二是优化数据处理与分析，选择合适的模型（如双位点模型或考虑质量传递影响的模型），对整个数据集进行全局拟合，并仔细校正基线和扣除背景信号，减少误差。

02

请问做多肽和蛋白结合时，氨基偶联法固定蛋白，结果发现baseline一直在上升，有什么办法解决呢？

董海辉：若发现基线一直在上升，可能是由于缓冲液或样品中存在非特异性吸附导致的。可以尝试在缓冲液中添加适量的BSA（如1%），或加入适量的表面活性剂（如吐温20），增加洗涤步骤以减少非特异性吸附；或者调整流速，适当提高流速，有助于减少蛋白在芯片表面的非特异性吸附。

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想问下最后一个案例，使用捕获法后，得到的响应值在30RU左右，比预期高，有没有可能是结合位点不止一个？

董海辉：一般来说，抗体捕获法后得到的响应值出乎意料的高，可能有多种原因。结合位点不止一个确实可能导致较高的响应值，但还有其他因素也可能导致这种情况。例如，抗原结合过程中可能存在非特异性吸附，或者实验条件（如缓冲液成分、流速等）不理想。此外，抗体本身的亲和力过高，或者抗原浓度过高也可能导致响应值偏高。

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共价非可逆化合物可以用这个方法测亲和力吗？

董海辉：是可以使用的，例如，使用单循环方法，通过在多个不同浓度下进行单次注射，观察结合曲线的饱和情况，从而间接推断亲和力。需要注意的是，共价非可逆化合物的亲和力测量结果可能受到实验条件（如浓度、温度、缓冲液组成等）的显著影响，因此在设计实验和解读结果时需要特别小心。

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如何判断是否存在非特异性吸附呢？

董海辉：判断是否存在非特异性吸附，可查看数据分析中的“Binding to reference”质控参数。若该参数值超过活性通道扣减参比通道信号值的20%，则可能表明存在显著的非特异性吸附。为减少非特异性吸附，可优化实验条件，如在缓冲液中加入适量BSA或表面活性剂（如吐温20），控制固定量，延长再生时间，以及确保抗体或抗原具有高特异性。

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（转自：美迪西Medicilon）